质粒dna的少量制备

质粒DNA的大量制备

基本方案1:碱裂解法制备粗制裂解物

01 实验材料

  • 含有氨苄青霉素或其他适当的选择性试剂的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)
  • 带有质粒的大肠杆菌菌株
  • 葡萄糖/Tris/EDTA (GTE)溶液卵清溶菌酶
  • NaOH/SDS 溶液
  • 3 mol/L乙酸钾溶液,pH 约5.5
  • 异丙醇
  • 70%乙醇
  • 约20 ml容量的高速离心管

02 实验步骤

1)往5 ml的含选择性试剂(通常是氨苄青霉素)的LB培养基或丰富培养基接种单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。

2)往2L烧瓶中加入 500 ml含有适当抗生素的LB培养基,然后加人1 ml过夜培养的大肠杆菌培养物,再于37℃培养至饱和状态(OD600≈4),于4℃,6000 g 离心10 min。

注意:为提高产量,应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度﹔振摇速度应大于400r/min。

3)用4 ml GTE溶液重悬沉淀,并转移到一个容积≥20 ml的高速离心管中。

4)加入1 ml新配的含25 mg/ml溶菌酶的GTE溶液(终浓度5 mg/ml),彻底重悬沉淀,于室温放置10 min。

注意:如果 DNA要用层析法纯化,加入50 ug/ml RNA酶A以降解RNA。

5)加人10 ml新配的NaOH/SDS溶液,并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而黏稠。于冰上放置10 min。

6)加入7.5 ml 3 mol/L乙酸钾溶液,用吸管轻轻搅拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放置10 min。

7)于4℃,20 000 g离心10 min,将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中,如果有可见的漂浮物可用数层纱布过滤。

8)加入0.6倍体积的异丙醇,颠倒混匀,室温放置5~10 min。

9)室温,15 000 g 离心10 min。弃上清,加入2 ml 70%乙醇轻轻洗涤沉淀。

10)室温,15 000 g短暂快速离心,吸去乙醇,并真空干燥。4℃无限期保存。

基本方案2:氯化铯/溴化乙锭平衡离心法

01 实验材料

  • 来自于粗裂解物制备的沉淀或上清
  • TE缓冲液pH 7.5
  • 氯化铯(CsCl)
  • 10 mg/ml溴化乙锭溶液
  • Dowex AG5OW-X8阳离子交换树脂
  • l g/ml CsCI/TE溶液
  • 0. 2 mol/L NaCI/TE缓冲液100%乙醇和70%乙醇
  • 5 ml 快封超离心管

02 实验步骤

1)粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE缓冲液中,加人4.4 g CsCl,溶解后,再加入0.4 ml 10 mg/ml溴化乙锭。

注意:溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染,操作时应戴手套,并且妥善处理。

2)将溶液转入一个5 ml 的 quick-seal 快速封口的超离心管中,往管中加人1 g/ml CsCl/TE溶液,封好离心管。

3)于20℃,500 000 g 离心3.5 h或于20℃,以350 000 g 离心14 h 以上。

注意:必须在温度不低于15℃下离心,这是为了防止对转子和离心机的损坏以及潜在的严重的人员伤害。

4)小心地取出管子,从管的顶端插人一支20-G针头,然后用带另一20-G针头的3 ml注射器将质粒带吸出(针头插入质粒带下约1 cm)。

注意:为了防止紫外线对眼睛的严重损伤,应戴紫外防护眼镜或面罩。操作溴化乙锭时要戴手套。

5)为了得到更高纯度的质粒DNA,在新管中进行第二次超速离心,管顶加有含0.1mg/ml溴化乙锭的CsCl/TE缓冲液。

6)按质粒DNA/EB溶液的1.5~2倍体积装 Dower AG50W-X8柱子,用数倍体积的TE/0.2 mol/L NaCl溶液清洗和平衡柱子。

7)用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部,注意不要摇动树脂。立即收集流出液。

8)用2倍于上样质粒溶液体积的0.2 mol/L NaCl /TE溶液洗脱柱子两次,用同一管子收集流出液。也可以用等体积TE饱和的正丁醇来除去溴化乙锭。充分涡旋振荡混勾,然后除去有机相,重复几次直至在紫外灯下看不见红色,然后加入3倍体积TE缓冲液来稀释氯化铯。

注意:在本方法中产生的含有溴化乙锭的有机废物应该妥善处理。

9)加入 2 倍体积100%乙醇于室温或-20℃沉淀质粒DNA,于 4℃,以 10 000 g 离心10 min。沉淀 DNA时温度不要低于-20℃,以免氯化铯沉淀下来。

10)沉淀用70%乙醇洗涤1遍,真空干燥,溶解于TE缓冲液,并于4℃保存。

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