质粒dna的少量制备- 畅鱼网

基本方案1：碱裂解法制备粗制裂解物

01 实验材料

02 实验步骤

1)往5 ml的含选择性试剂（通常是氨苄青霉素）的LB培养基或丰富培养基接种单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。

2)往2L烧瓶中加入 500 ml含有适当抗生素的LB培养基，然后加人1 ml过夜培养的大肠杆菌培养物，再于37℃培养至饱和状态（OD600≈4)，于4℃，6000 g 离心10 min。

注意：为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度﹔振摇速度应大于400r/min。

3）用4 ml GTE溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20 ml的高速离心管中。

4)加入1 ml新配的含25 mg/ml溶菌酶的GTE溶液（终浓度5 mg/ml)，彻底重悬沉淀，于室温放置10 min。

注意：如果 DNA要用层析法纯化，加入50 ug/ml RNA酶A以降解RNA。

5）加人10 ml新配的NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而黏稠。于冰上放置10 min。

6)加入7.5 ml 3 mol/L乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10 min。

7)于4℃，20 000 g离心10 min，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的漂浮物可用数层纱布过滤。

8)加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5~10 min。

9)室温，15 000 g 离心10 min。弃上清，加入2 ml 70%乙醇轻轻洗涤沉淀。

10)室温，15 000 g短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥。4℃无限期保存。

基本方案2：氯化铯/溴化乙锭平衡离心法

01 实验材料

02 实验步骤

1）粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE缓冲液中，加人4.4 g CsCl,溶解后，再加入0.4 ml 10 mg/ml溴化乙锭。

注意:溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染，操作时应戴手套，并且妥善处理。

2)将溶液转入一个5 ml 的 quick-seal 快速封口的超离心管中，往管中加人1 g/ml CsCl/TE溶液，封好离心管。

3)于20℃，500 000 g 离心3.5 h或于20℃，以350 000 g 离心14 h 以上。

注意:必须在温度不低于15℃下离心，这是为了防止对转子和离心机的损坏以及潜在的严重的人员伤害。

4)小心地取出管子，从管的顶端插人一支20-G针头，然后用带另一20-G针头的3 ml注射器将质粒带吸出（针头插入质粒带下约1 cm)。

注意:为了防止紫外线对眼睛的严重损伤，应戴紫外防护眼镜或面罩。操作溴化乙锭时要戴手套。

5）为了得到更高纯度的质粒DNA，在新管中进行第二次超速离心，管顶加有含0.1mg/ml溴化乙锭的CsCl/TE缓冲液。

6）按质粒DNA/EB溶液的1.5～2倍体积装 Dower AG50W-X8柱子，用数倍体积的TE/0.2 mol/L NaCl溶液清洗和平衡柱子。

7)用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部，注意不要摇动树脂。立即收集流出液。

8）用2倍于上样质粒溶液体积的0.2 mol/L NaCl /TE溶液洗脱柱子两次，用同一管子收集流出液。也可以用等体积TE饱和的正丁醇来除去溴化乙锭。充分涡旋振荡混勾，然后除去有机相，重复几次直至在紫外灯下看不见红色，然后加入3倍体积TE缓冲液来稀释氯化铯。

注意：在本方法中产生的含有溴化乙锭的有机废物应该妥善处理。

9)加入 2 倍体积100%乙醇于室温或-20℃沉淀质粒DNA，于 4℃，以 10 000 g 离心10 min。沉淀 DNA时温度不要低于-20℃，以免氯化铯沉淀下来。

10）沉淀用70%乙醇洗涤1遍，真空干燥,溶解于TE缓冲液，并于4℃保存。

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