核酸试剂采购指南
PCR试剂简单的理解就是用于做PCR的试剂。试剂中不应该存在对PCR反应有影响的杂质。像核酸、核酸酶,如果是水的话,盐离子尽可能的小,最好是超纯水。像一些盐类,分析纯的可以达到要求。
NO.1-PCR试剂的分类
1、提取试剂:包括了各种提取DNA的常用试剂,和纯化DNA所用的试剂;
2、PCR扩增试剂:主要是taq酶,dntp,缓冲试剂,引物;
3、产物检测试剂:琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、aps、tmed、eb等等。
NO.2-PCR试剂的原理
PCR的原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度,DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖的方向合成互补链。
PCR最有价值的应用领域就是对感染疾病的诊断。理论上,只要样本有一个病原体存在,PCR就可以检测到。
NO.3-PCR试剂注意事项
1、PCR实验一定要保管好试剂,防止交叉污染,尤其是交叉使用,极易引起污染。
2、NA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理,常规消耗用品用后作一次性处理,避免反复使用造成污染。
3、超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品,移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器,防止移液器基部污染。
4、PCR操作应戴手套并勤于更换。
5、成套试剂,小量分装,专—保存,防止它用。配制试剂用新器具,用后作一次性处理。
6、试剂管用前先瞬时离心,使液体沉于管底,减少污染手套与加样器机会。
7、引物稀释时,要首先瞬时离心,以避免粉末状引物在开盖时弹出管外。
NO.4-PCR试剂的操作流程
1、试剂准备阶段:
试剂准备是PCR操作的第一个流程,需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行,用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。
所有的PCR体系都应该在-20C保存,除了ddH 20之外,其余的试剂组份需完全融化之后再加入,以免影响浓度。
配制反应体系应在快速进行,以减少非特异性扩增。
体系配制完成之后应马上进行PCR反应。
2、样本制备阶段:
样本制备是整个PCR反应中最为关键的环节,在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。
严格遵守操作规程进行加样操作,操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行,操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒,注意生物安全柜中物品的排放。
3、核酸扩增:
在核酸扩增环节需要选择质量好的EP管,装入反应体系的EP管上机前混匀、离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部。
在样本检测的同时设立对照。
同时严密检测PCR扩增仪的各项性能指标,其中对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。
NO.5-如何选购PCR试剂
一般试剂盒主要是针对酶分类,其次是分为简易操作混合体系和分开单独体系。
先说酶,你的基因如果是小于2K,那么普通的高保真酶就可以满足。
如果是长片段就选择各公司针对长片段设计的酶。如果不需要对序列保真度要求很高,只需要鉴定一下,那么普通的taq酶就够了。
针对体系问题,如果你的基因有文献参考成熟的体系,那么一般就定混合体系那种premix的就可以,如果对Mg离子等有特殊要求,就选择分开自己配体系那种。
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